1. Tế bào được bảo quản lạnh phải ở trạng thái phát triển tốt (pha log) và tỷ lệ sống cao, với mật độ khoảng 80-90%.
2. Kiểm tra xem các tế bào có còn giữ được các đặc tính độc đáo của chúng hay không trước khi đóng băng.
Ví dụ, hybridoma nên được kiểm tra sản xuất kháng thể từ một đến hai ngày trước khi bảo quản lạnh.
3. Chú ý đến chất lượng của chất bảo vệ lạnh.
DMSO phải là loại thuốc thử, vô trùng và không màu (được lọc bằng FGLP Telflon 0,22 micron hoặc các sản phẩm vô trùng mua trực tiếp, chẳng hạn như Sigma D-2650), được chiết xuất với thể tích nhỏ 5-10 ml, được bảo quản ở 4 oC trong bóng tối. Không rã đông nhiều lần. Glycerol cũng phải là loại thuốc thử và được bảo quản trong bóng tối sau khi hấp tiệt trùng. Sử dụng trong vòng một năm sau khi mở, vì nó sẽ gây độc cho tế bào sau khi bảo quản lâu dài.
4. Nồng độ tế bào để bảo quản lạnh:
(1) Nguyên bào sợi của người bình thường: 1 ~ 3 x 106 tế bào / ml
(2) Hybridoma: 1 ~ 3 x 106 tế bào / ml, nồng độ tế bào không được quá cao, một số hybridoma sẽ chết sau khi rã đông 24 giờ do nồng độ đông đặc cao.
(3) Đường khối u kết dính: 5 ~ 7 x 106, tùy thuộc vào loại tế bào. Ung thư biểu mô tuyến cần nồng độ cao hơn sau khi tan băng, trong khi HeLa chỉ cần 1-3 x 106 tế bào / ml.
(4) huyền phù khác: 5 ~ 10 x 106 tế bào / ml, tế bào lympho người ít nhất phải 5 x 106 tế bào / ml.
5. Nồng độ chất bảo vệ lạnh là 5 hoặc 10% DMSO. Nếu điều kiện đông lạnh của tế bào không chắc chắn, nên sử dụng mẫu cấy dự phòng trong khi bảo quản lạnh để ngăn ngừa sự cố đông lạnh.
6. Phương pháp đông lạnh:
(1) Phương pháp truyền thống: 4 oC 10 phút ---> -20 oC 30 phút ---> -80 oC 16-18 giờ (hoặc qua đêm) ---> Bảo quản lâu dài trong pha hơi của bình nitơ lỏng .
(2) Làm mát theo chương trình: Sử dụng máy làm mát tốc độ không đổi để giảm từ nhiệt độ phòng xuống –120 oC với tốc độ –1 ~ -3 oC / phút, và lưu trữ nó trong pha hơi của bình nitơ lỏng trong thời gian dài- lưu trữ có thời hạn. Nó thích hợp để bảo quản các tế bào huyền phù và hybridoma.
7. Chất liệu:
(1) Tế bào nuôi cấy phát triển tốt
(2) Tươi vừa
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Ống bảo quản lạnh bằng nhựa vô trùng (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4% w / v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
(6) Tấm kính đo huyết cầu và kính che
(7) Máy làm mát tốc độ không đổi (KRYO 10 Series II)
8. Các bước:
(1) Thay đổi một nửa hoặc toàn bộ lượng môi trường một ngày trước khi đông lạnh và quan sát sự phát triển của tế bào.
(2) Pha chế dung dịch bảo quản lạnh (chuẩn bị trước khi sử dụng): Cho DMSO vào môi trường tươi, nồng độ cuối cùng là 5-10%, trộn đều, để ở nhiệt độ phòng để sử dụng sau.
(3) Theo thao tác nuôi cấy tế bào, lấy tế bào nuôi cấy và lấy một lượng nhỏ huyền phù tế bào (khoảng 0,1 ml) để đếm nồng độ tế bào và tỷ lệ sống sót trước khi cấp đông.
(4) Ly tâm, loại bỏ phần nổi phía trên, thêm một lượng thích hợp dung dịch bảo quản lạnh để tạo nồng độ tế bào 1-5 x 106 tế bào / ml, trộn đều và phân phối vào ống bảo quản lạnh được dán nhãn, 1 ml / lọ, và lấy một lượng nhỏ lượng huyền phù tế bào để phát hiện nhiễm bẩn.
(5) Phương pháp bảo quản lạnh 1: Ống đông lạnh được đặt ở 4 oC trong 10 phút → -20 oC trong 30 phút → -80 oC trong 16 đến 18 giờ (hoặc qua đêm) → bình nitơ lỏng pha hơi để bảo quản lâu dài.
(6) Phương pháp bảo quản đông lạnh 2: Ống cấp đông được đặt trong máy làm lạnh vận tốc không đổi với chương trình đã thiết lập, sau đó được đặt trong bình nitơ lỏng.
英语
阿拉伯语
���ļ���